PENETUAN STRUKTUR SENYAWA ALKALOID DARI SENYAWA BIOAKTIF DARI AKAR KUNING

Isolasi senyawa bioaktif dari akar kuning (F.chloroleuca) koleksi hutan Kalimantan tengah (#03-SBK-029) telah dilakukan dengan metoda Bioassay Guided Isolation dan diperoleh senyawa tunggal (F-1) dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) (Wahyuono dkk., 2006). Senyawa F-1 (500 μg/ml) menghambat 20,08% pertumbuhan sel HeLa in vitro. Aktivitas penghambatan pertumbuhan sel ini relatif kecil pada dosis cukup besar ini, kemungkinan disebabkan karena F-1 tidak sensitif terhadap sel HeLa namun lebih sensitif terhadap sel kanker lain. Identitas suatu senyawa sangat penting dalam menentukan arah dan potensi aktivitas suatu senyawa, oleh karena itu struktur senyawa F-1 perlu ditentukan. Pada publikasi ini dilaporkan penentuan struktur F- 1 secara spektroskopi yaitu spektroskopi ultraviolet (UV) untuk melihat apakah F-1 mempunyai suatu kromofor, spektroskopi inframerah (IR) untuk melihat adanya gugus fungsional dan spektroskopi massa (MS) untuk mendapatkan informasi bobot molekul F-1. Struktur absolut F-1 dilakukan dengan
spektroskopi Nuklir Magnetik Resonans (NMR) baik 13C- maupun 1H- NMR.

METODOLOGI PENELITIAN

B a h a n : Senyawa F-1 (mp. 182,4-183,00C) hasil isolasi dari akar kuning (F. chloroleuca,
#03-SBK-029) (Wahyuono dkk., 2006).
A l a t : Spektrofotometer UV-vis (Milton Roy Spectronic 3000), IR (Shimadzu FTIR-
8201PC) dan MS (Shimadzu QP-500), NMR (Bruker DPX-600, 600 MHz).
Cara Kerja : Spektrum UV diperoleh terhadap senyawa F-1 (2.1 mg) dilarutkan dalam CHCl3
(4,0 ml); Spektrum IR diperoleh dengan pellet KBR. Spektrum Massa (MS) diperoleh
melalui GC-NS, F-1 dilarutkan dalam CHCl3. Spekra 13C- dan 1H-NMR F-1 diperoleh dari
Bruker DPX-600 (University of Leiden, Leiden, the Netherlands).

HASIL DAN PEMBAHASAN
Senyawa F-1 mempunyai jarak lebur yang tajam pada 182,4-183,00C, mempunyai panjang gelombang (λ) maksimal (CHCl3) pada 345 (0,514); 241 (0,637); 210 (0,312) yang menginformasikan bahwa F-1 mempunyai kromofor (Gambar 1). Pada λ 345 nm mengindikasikan ikatan rangkap terkonjugasi panjang, mungkin juga merupakan suatu aromatik. Senyawa F-1 memberi reaksi positif dengan penampak bercak spesifik (Dragendorff) pada KLT yang mengindikasikan bahwa F-1 merupakan senyawa alkaloida (Wahyuono dkk., 2006).

 Spektrum inframerah (IR) (KBr) (Gambar 2) senyawa F-1 menunjukkan adanya vibrasi ulur (3433 cm-1) yang menunjukkan adanya gugus –OH atau –NH pada senyawa F-1. Vibrasi ulur dari suatu metin tidak jenuh (=CH) nampak pada 3010 cm-1 dan metilen –CH2, metin jenuh (-CH) pada 2800-2900 cm-1 ( Silverstein dkk., 1981). Pita serapan –C=O nampak pada 1645 cm-1 memberi indikasi bahwa –C=O tersebut sebagai –C=O terikat oleh suatu atom –N- terikat sebagai gugus amida (-N-C=O). Keberadaan gugus aromatik seperti yang nampak pada data spektrum UV, dipertegas dengan adanya serapan pada 1600- 1585 dan 1500-1400 cm-1 merupakan serapan ulur dari –C=C- aromatik. Oleh karena itu, F-1 dapat dipastikan sebagai suatu senyawa aromatik, alkaloid yang mempunyai ikatan amida.

 Data GC-MS (Gas Chromatography – Mass Spectrometry) menunjukkan bahwa senyawa F-1 merupakan senyawa murni dengan tingkat kemurnian 100% (GC) dengan waktu retensi (Rt.) 5,19 menit dan mempunyai puncak molekul ion pada m/z 351 (Gambar 3). Puncak ion molekul [M]+. ganjil (m/z 351) menginformasikan bahwa dalam struktur F-1 terdapat atom nitrogen (-N-) dalam hitungan ganjil (1, 3, 5, 7 dst.), pengertian ini dikenal dengan istilah Nitrogen Rules (Silverstein dan
Websters, 1998). Perkiraan identitas sebagai alkaloid ini konsisten dengan hasil visualisasi F-1 pada kromatografi lapis tipis dengan penampak spesifik alkaloid Dragendorff memberi warna merah oranye (Wahyuono dkk., 2006).

 Tabel 1. Pergeseran kimia karbon dan proton 8-oksorpotoberberin (F-1) berdasarkan atas
data 1H- dan 12C-NMR (600 MHz, CDCl3)

 

 Spektrum 13C-NMR (600 Mhz, CDCl3) dari F- 1 menginformasikan adanya 20 atom karbon,
dan berdasarkan atas data 13C-NMR dengan teknik APT (Attached Proton Test) (Gambar 4) diketahui bahwa dalam F-1 terdapat 10 atom -C sebagai C-kuaterner aromatik (δ, 161,06; 152,38; 150,51; 149,40; 148,31; 136,60; 133,32; 131,00; 124,72; 120,36 ppm) , 5 =CH aromatik (δ, 123,23; 119,98; 108,88; 105,65; 102,25 ppm) , 1 -CH2 dioksida (δ, 102,38 ppm) , 2 metoksi (δ, 62,57; 57,84 ppm) , dan 2 –CH2 (δ, 40,32 dan 29,68 ppm) yang salah satunya terikat oleh suatu elektronegatif
atom (δ, 40,32 ppm) (Friebolin, 2005). Spektrum 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) (Gambar 5) F-1 nampak sangat sederhana, berdasarkan atas perhitungan rasio integrasinya diketahui bahwa jumlah proton pada F-1 adalah 17 proton. Berdasarkan atas data 13C-NMR dan spektrum massa tersebut
diatas, elemen penyusun senyawa F-1 dapat ditentukan sebagai C20H17O5N. Berdasarkan data diatas dan literatur, identifikasi F-1 mengarah pada alkaloida protoberberine atau tetrahidroberberine dan letak gugus –C=O berdampingan dengan atom –N membentuk ikatan amida (Gambar 6). Spektrum 1H-NMR F-1 menunjukkan adanya signal pada δ, 2,94 pp (t, J= 6.5 Hz,2H) yang coupled dengan signal pada δ, 4,34 ppm (t, J=6.0 Hz, 2H) menurut data 2D-NMR (COSY, Corelation spectroscopy) (Gambar 7). Hal ini menjelaskan bahwa kedua gugus –CH2 berdampingan dan saling coupled (First order), dan pergeseran kimia yang down field gugus –CH2 (δ, 4.34 ppm) sebagai –CH2-N-C=O. Sedangkan gugus – CH2 yang up filed (δ, 2,94 ppm) adalahCH2 pada posisi β dari atom –N-. Signal singlet terintegrasi sebagai 2 proton pada δ, 6,05 ppm merupakan gugus –CH2- dioksida (Wahyono, 2005; Friebolin, 2005) yang tidak ter-coupled oleh proton lain dari molekul. Posisi metilenedioksida (-O-CH2-O-) terbukti terletak pada ring-A dari pada ring-D, karena proton metilena tidak ter-coupled oleh proton lain (H-1 dan H-4) pada 2D-NMR dengan teknik NOESY (Nuclear overhauser effects spectroscopy). Demikian pula dengan posisi dua –OCH3 group, kedua gugus ini terletak pada ring-D yaitu pada C-9 dan C-10. Hal ini nampak pada 2D-NMR NOESY terjadi longrange coupling antara –OCH3 (C-10) dengan H-11, selain itu nampak adanya first order
coupling antara H-11 dan H-12 (dublet, J= 7,0 Hz, ortho) yang menginformasikan lebih jauh bahwa posisi kedua gugus –OCH3. Gugus –OCH3 (C-9) lebih dowbfield dibandingkan dengan –OCH3 (C-10) karena pengaruh gugus –C=O yang electron withdrawing memungkinkan –OCH3 (C-9) sedikit lebih dowbfield. Identifikasi dan hubungan antara carbon dan proton terkait dapat disusun seperti pada tabel 1 berdasarkan atas data 2D-NMR dengan teknik Het-Cor (Heteronuclear correlation) (Gambar 8).Senyawa F-1 diidentifikasi berdasarkan atas data spektroskopi dan dibandingkan dengan data spektroskopi dari literatur (Suau dkk., 2000) sebagai 8-oxoprotoberberine. Senyawa ini dilaporkan mempunyai kemampuan menginterkalasi DNA (Liu dkk., 2002).

 

Permasalahan :

1. Spektrum 1H-NMR F-1 menunjukkan adanya signal pada δ, 2,94 pp (t, J= 6.5 Hz,2H) yang coupled dengan signal pada δ, 4,34 ppm (t, J=6.0 Hz, 2H) menurut data 2D-NMR . Signal singlet terintegrasi sebagai 2 proton pada δ, 6,05 ppm merupakan gugus –CH2- dioksida  yang tidak ter-coupled oleh proton lain dari molekul. Posisi metilenedioksida (-O-CH2-O-) terbukti terletak pada ring-A dari pada ring-D, karena proton metilena tidak ter-coupled oleh proton lain (H-1 dan H-4) pada 2D-NMR, disini yang ingin sy tanyakan, bisakah anda menjelaskan pada  Spektrum 1H-NMR F-1 kenapa ada signal yang saling coupled  dan ada signal yang tidak ter-coupled oleh proton lain dari molekul? apa yang mempengaruhinya? 

2. berdasarkan Data GC-MS (Gas Chromatography – Mass Spectrometry) menunjukkan bahwa senyawa F-1 merupakan senyawa murni dengan tingkat kemurnian 100% (GC) dengan waktu retensi (Rt.) 5,19 menit dan mempunyai puncak molekul ion pada m/z 351 (Gambar 3). bagaimana kita bisa membuktikan senyawa tersebut murni atau tidak murni dengan spektroskopi massa?