Isolasi Dan Pemurnian Senyawa Flavonoid dari Kulit Buah Mahkota Dewa (Phaleria Macrocarpa)

       I. FLAVONOID

 

Senyawa flavonoid adalah senyawa yang mengandung C5 terdiri atas dua inti fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan carbon. Cincin A mamiliki karakteristik bentuk hidroksilasi floroglusinol atau resorsinol, dan cincin B biasanya 4-, 3,4- atau 3,5,4-terhidroksilasi^.

 

  Struktur dasar flavonoid:

 

 

II.  CONTOH CARA KERJA: Isolasi Dan Pemurnian Flavonoid dari Kulit Buah Mahkota Dewa (Phaleria Macrocarpa)

a.      Tujuan

1)      Dapat mengekstraksi kulit buah mahkota dewa dengan metode perkolasi

2)      Dapat mengisolasi flavonoid dari Kulit Buah Mahkota Dewa dengan metode KLT preparatif

3)      Dapat melakukan pemurnian hasil isolasi flavonoid dengan KLT 2 dimensi

b.      Metode

1)      Alat

a)      Seperangkat alat perkolasi

b)      Seperangkat alat KLT

c)      Seperangkat alat spektrofotometri UV

d)     Rotary evaporator

e)      Tabung reaksi

f)       Corong pisah

g)      Gelas ukur

h)      Gelas Beaker

i)        Pipet

j)        Spatula

k)      Pengaduk kaca

l)        Penggaris

2)      Bahan

a)      Serbuk kulit buah mahkota dewa

b)      Kapas

c)      Aquades

d)     Asam asetat pa

e)      Metanol pa

f)       Butanol pa

g)      Plat silika 60F

h)      Silika 60F

i)        Kertas saring

3)      Cara kerja

a)        Ekstraksi serbuk buah Mahkota dewa

Ditimbang 10 gram serbuk mahkota dewa, dimasukkan kedalam alat perkolator, diekstraksi dengan larutan n-heksan.

Residu diekstraksi dengan menggunakan metanol dengan perkolator sampai jernih (dicatat volume metanol dan sari metanol)

Sari metanol dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator, ekstrak pekat yang diperoleh ditimbang dan disimpan dalam wadah tertutup.

Dilakukan penjenuhan bejana oleh uap pengembang, pengembang yang digunakan : n-heksan, metanol, BAW 4:1:5, dan BAW 9:2:6

Ekstrak metanol ditotolkan pada plat KLT 2x10 cm, dilakukan pengembangan plat KLT setelah bejana jenuh.

Dideteksi bercak pada sinar tampak dan lampu UV 254 nm dan 366 nm.

Dicatat warna bercak dan Rf dari setiap pengembang yang digunakan, ditentukan eluen yang paling baik dan digunakan untuk pemisahan dengan KLT preparatif.

b)      Pemurnian Flavonoid menggunakan KLT preparatif

Pemisahan flavonoid menggunakan KLT preparatif dilakukan pada plat KLT 5x10 cm, pengembang yang digunakan adalah pengembang terbaik pada deteksi awal.

Dideteksi dengan menggunakan lampu UV 366 nm, bercak dengan pita ditandai dengan pensil.

Bercak yang ditandai dikerok dan dilarutkan dalam metanol.

Dilakukan identifikasi menggunakan spektrofotometer UV dengan λ 256 nm.

c)      Pembuktian kemurnian flavonoid

Dilakukan dengan teknik KLT 2 dimensi, pengembangan dilakukan pada plat KLT 6x6 cm.

Ekstrak metanol ditotolkan 1 cm dari tepi bawah kanan

Pengembang pertama yang digunakan adalah pengembang terbaik dari identifikasi awal, pengembang kedua menggunakan pelarut asam asetat 15%.  Plat dielusi pada posisi 90° dari kondisi mula-mula

 

Cara menggunakan alat perkolator

Alat perkolator sebelumnya harus dibersihkan dulu utntuk menghilangkan pengotor. selanjutnya masukkan kapas kedalam alat perkalator, dipadatkan. Tinggi kira-kira sama dengan diameter perkolator tsb. masukkan kertas saring diatas kapas sesuai dengan ukuran perkolator (bulat), setelah itu tambhakan simplisia yang akan diekstraksi (yang sebelummya telah dibasahkan dengan pelarut yang digunakan), padatkan kemudia kembali masukkan kertas saring diatasnya. setelah itu, tambahkan pelarut hingga semua simplisia terendam. Setelah itu pelarut dialirkan, saat pelarut telah sampai dibatas paling atas simplisia, segera tambahkan pelarut lagi.

Cara pembuatan pengembang BAW

BAW --> Buthanol, Acetic acid, Water

Ukur masing-masing jumlah volume sesuai dengan yang dibutuhkan. Campurkan kedalam corong pisah, kemudian gas di keluarkan. Diamkan minimal 1 x 24 jam (terjadi pemisahan 2 fase). Bagian yang digunakan adalah yang atas.

Pemilihan eluen terbaik berdasarkan jumlah spot yang dihasilkan, semakin banyak spot, maka semakin baik eluen tersebut.

Cara pembuatan plat KLT preparatif

Timbang 30 gram silika kemudian dilarutkan dalam 60mL aquades. Dibuat plat KLT dengan ketebalan 0,25 mm. Lakukan pekerjaan ini dengan cepat.

Deteksi dengan Spektrofotometer UV 
Speoktrofotometer merupakan alat untuk mengukur transmitan atau serapan suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang.

Unsur-unsur penting dalm spektorfotometer
1. Sumber lampu: lampu duetrium digunakan untuk daerah UV pada panjang gelombang dari 190-350 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu tungsten digunakan untuk daerah visible (pada panjang gelombang 350-900 nm)
2. Monokromator: diginakan untuk memperoleh sumber sianr yang monokromatis
3. Kuvet: tempat sampel
4. Detektor: pemberi respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang yang selanjutnya dibaca pada sistem komputer
5. Amplifier
6. Sistem pembacaan

Pustaka

1.      Anonim. 2003. Ilmu Galenika. Dinas Kesehatan. Jakarta. 64-65

2.      Sastrohamidjojo, Hardjono., 2001, Kromatografi, Liberty, Yogyakarta.

3.      Hostettmann, K., dkk., 1995, Cara Kromatografi Preparatif, Penerbit ITB, Bandung.

4.      Rahman, Abdul., dkk., 2008, Kimia Farnmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta.

5.      Sastrohamidjojo, Hardjono. 1996. Sintesis Bahan Alam. UGM Press. Yogyakarta. 140

 

PERMASALAHAN :

 

1. Pada Ekstraksi senyawa Flavonoid pada kulit buah mahkota dewa,Dilakukan penjenuhan bejana oleh uap pengembang, pengembang yang digunakan : n-heksan, metanol, BAW 4:1:5, dan BAW 9:2:6. yang ingin saya tanyakan pada pengembang yang di gunakan terdapat perbandingan BAW ( Butanol, Asam Asetat, Air ) 4 : 1 : 5 dan BAW 9 : 2 : 6, Mengapa pada mengisolasi senyawa flavonoid dilakukan  dengan 2 Pengembang  Butanol : Asam Asetat : Air  dengan perbandingan yg berbeda? dan bagaiman cara kita mengatur/ menentukan perbandingannya?

2.  pada pemurnian Flavonoid pada artikel diatas yaitu Pemisahan flavonoid menggunakan KLT preparatif dilakukan pada plat KLT 5x10 cm, pengembang yang digunakan adalah pengembang terbaik pada deteksi awal. bagaimana cara kita menentukan pengembang yang terbaik ataupun yang kurang baik, dalam proses pemurnian senyawa flavonoid tersebut?

 

PENENTUAN STRUKTUR SENYAWA TERPENOID DARI EKSTRAK ETIL ASETAT KULIT BATANG TUMBUHAN KECAPI

MATERI DAN METODE

Bahan

Sampel yang digunakan adalah kulit batang dari tumbuhan kecapi. Bahan kimia yang  digunakan sebagai pelarut pada proses ekstraksi dan pemurnian adalah heksana, etil asetat,  dan metanol, pelarut yang digunakan berkualitas teknis dan p.a. Adsorben yang dipakai pada  proses kolom kromatografi adalah silika gel 60 Art,77733 keluaran Merck. Pereaksi Meyer  dipakai untuk identifikasi alkaloid, pereaksi Liebermann-Burchad untuk identifikasi  terpenoid dan steroid, sianoda test untuk identifikasi flavonoid dan FeCl3 untuk identifikasi  fenolik. Disamping itu juga dipakai kertas saring whatman, alumunium foil dan tisu.

Peralatan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : alat-alat gelas  yang umum dipakai pada penelitian kimia organik bahan alam, seperangkat alat desrilasi  pelarut, rotary evaporator Heidolp WB 2000, oven, pipa kapiler, plat KLT ( silika gel 60 F  254), kolom kromatografi, oven, lampu ultraviolet untuk pengungkap noda model UV GL – 58  UV 254 nm, fisher jhon melting point apparatus. Spektroskopi ultra violet UV-Vis Secomam  S 1000 PC, spektroskopi infra merah FTIR Perkin Elmer 1600 series, spektroskopi JEOL 600  MHz JNM-ECA (13C-NMR, 1H- NMR , DEPT dan NMR-2 D).

Cara Kerja

Kulit batang Tumbuhan kecapi diambil di Hutan Penelitian dan Pendidikan Biologi  Universitas Andalas. Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Universitas Andalas  Padang (ANDA). Kulit batang tumbuhan kecapi (10 kg) terlebih dahulu dikering anginkan  dan dijaga agar tidak terkena sinar matahari secara langsung sampai beratnya konstan, setelah  kering dihaluskan hingga diperoleh serbuk kering kulit batang tumbuhan kecapi (2,9 kg) dan  siap untuk di ekstraksi.

isolasi, tetap menghasilkan noda tunggal. Selanjutnya juga dilakukan analisis titik leleh, dan diperoleh suhu titik leleh 224-226 oC, maka senyawa ini dapat dikatan murni dengan berat 32 mg.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi serbuk kering kulit batang tumbuhan kecapi (2,5 kg) menggunakan metoda  maserasi dengan pelarut heksan pada suhu kamar selama 4 x 72 jam, kemudian ekstrak  heksan yang diperoleh dilakukan evaporasi memakai penguap vakum (rotary evaporator)  diperoleh ekstrak kering heksan sebanyak 38 g. Selanjutnya ampas direndam kembali  dengan pelarut etil asetat pada suhu kamar selama 4 x 72 jam, kemudian ekstrak etil asetat  yang diperoleh dilakukan evaporasi dan diperoleh ekstrak kering etil asetat sebanyak 102 g.

 Hasil pemurnian 15 g ekstrak etil asetat dengan metoda kromatografi kolom gravitasi  dan pengelusian dilakukan secara bergradien menggunakan pelarut heksan, etil asetat dan  metanol diperoleh 485 vial/10 mL. Selanjutnya setelah vial dikeringkan, pada dinding vial  nomor 57 terbentuk kristal berwarna putih kekuningan. Kemudian vial nomor 57 dianalisis  dengan KLT dan terdapat noda tunggal. Kemudian dilanjutkan dengan pencucian dengan  heksan diperoleh kristal murni berwarna putih berbentuk jarum sebanyak 32 mg.

Sebelum dilakukan elusidasi struktur senyawa hasil isolasi dengan spektroskopi terlebih  dahulu dilakukan identifikasi dengan menggunakan pereaksi Liebermann-burchard, hasil identifikasi terbentuk bercak warna merah, hal ini menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi  merupakan senyawa golongan triterpenoid. Pengukuran titik leleh senyawa hasil isolasi  adalah 224 -226 oC , dengan range titik leleh 2 oC mengindikasikan bahwa senyawa hasil  isolasi relatif murni.

Senyawa golongan triterpenoid jarang yang dianalisis dengan menggunakan  spektrofotometer UV-Vis disebabkan karena strukturnya yang tidak menyerap sinar UV-Vis(Kristanti dkk, 2008). Gambar spektrum ultra violet senyawa hasil isolasi menunjukkan, λmax (log ε, nm ): 203 nm. Dari data tersebut menunjukan bahwa senyawa hasil isolasi adalah golongan triterpenoid.   

Spektrum IR memperlihatkan pita serapan yang melebar pada bilangan gelombang, υ max : 3453 cm-1 , mengindikasikan adanya gugus hidroksil, pita serapan pada bilangan gelombang, υ max : 2930 cm-1, merupakan serapan dari C-H alifatik, pita serapan pada bilangan gelombang, υ max : 1691 cm-1, merupakan serapan dari C=O dari asam karboksilat  yang diperkuat dengan adanya pita serapan pada bilangan gelombang, υ max : 1114 cm-1, pita  serapan pada bilangan gelombang, υ max : 1454 cm-1 CH2 dan pita serapan pada bilangan gelombang, υ max : 1384 cm-1 merupakan serapan dari C-H tekuk dari geminal dimetil yang  merupakan ciri khas senyawa triterpenoid yang mendukung data spektroskopi ultra violet.

Berdasarkan analisa data diatas dapat diusulkan bahwa senyawa hasil isolasi  merupakan senyawa dari golongan triterpenoid yang memiliki substituen keton dan asam karboksilat.

Pengukuran data spektrum 13C-NMR dijumpai 30 signal. Selanjutnya diketahui  adanya substituen keton dan asam karboksilat dengan munculnya signal karbon pada  pergeseran kimia 217, 92 ppm dan 181,53 ppm serta ditemukan juga satu ikatan rangkap  yaitu muncul signal karbon pada pergeseran kimia 125,98 ppm dan 137,67 ppm, maka berdasarkan pengujian dengan liebermann-burchard, spektroskopi ultra violet, spektroskopi infra merah dan spektroskopi resonansi magnetik inti karbon (13C NMR), senyawa hasil isolasi merupakan senyawa golongan triterpenoid yang memiliki 30 atom karbon, 3 atom oksigen dari gugus fungsi keton dan asam karboksilat serta memiliki sebuah ikatan rangkap.

Dari data tersebut diatas, maka senyawa hasil isolasi yang dapat diusulkan sementara  adalah senyawa triterpenoid turunan pentasiklik dengan kerangka oleanan dan turunan tiucallan.

Untuk mengetahui jumlah atam karbon primer, sekunder, tersier dan kuarterner dari  senyawa hasil isolasi maka dilakukan spektroskopi NMR karbon DEPT. Spektrum NMR  karbon DEPT dari senyawa hasil isolasi dilakukan pada frekwensi 45, 90 dan 135 MHz.  Dari spektrum DEPT pada frekwensi 135 MHz sepuluh signal muncul menghadap ke bawah,  signal ini merupakan signal dari CH2 dengan demikian senyawa ini memiliki sepuluh gugus  CH2. Kemudian dari spektrum DEPT pada frekwensi 135 MHz juga muncul sebelas signal  menghadap ke atas, signal ini merupakan signal dari CH3 dan CH. Selanjutnya percobaan  DEPT pada frekwensi 90 MHz di temukan empat signal. Dengan demikian senyawa hasil  isolasi memiliki tujuh gugus CH3 dan empat gugus CH. Karena ada sembilan signal karbon  yang tidak muncul pada DEPT 135 dan DEPT 45 MHz maka senyawa hasil isolasi memiliki  sembilan karbon kuarterner.

 Berdasarkan data tersebut senyawa hasil isolasi terdiri dari 30 karbon yang  terdistribusi pada 7 gugus metil (CH3), 10 karbon metilen (CH2), 4 karbon metin (CH)  dimana salah satunya dari ikatan rangkap alken (HC=) yang muncul pada peregeseran δc 125,98 ppm dan 9 karbon kuarterner (C) dan salah satunya karbon kuarterner dari ikatan  rangkap alken yang muncul pada pergeseran δc 137,67 ppm. Selanjutnya senyawa hasil  isolasi juga memiliki gugus karbonil dari keton yang ditunjukkan dengan adanya signal pada pergeseran kimia δc 217.92 ppm. Signal ini menunjukkan bahwa kemungkinan senyawa hasil isolasi mempunyai gugus keton pada posisi C-3. Selanjutnya senyawa hasil isolasi juga memiliki gugus karboksilat pada posisi tertentu, hal ini ditunjukkan adanya signal pada pergeseran kimia δc 181.53 ppm.

Berdasarkan dari data spektroskopi UV, IR, 13C NMR dan DEPT maka senyawa hasil isolasi yang lebih tepat untuk diusulkan sementara adalah senyawa triterpenoid pentasiklik  turunan oleanan dengan subtituen keton yang diperkirakan terletak pada atom C-3, subtituen asam karboksilat yang terletak pada atom C-29 dan ikatan rangkap dua pada atom karbon 12 (C-12) dan 13 (C-13). Senyawa ini dikenal dengan nama asam okso-3-oleanen-12-oat-29.

Untuk mengetahui jumlah proton dan jenis proton dari senyawa hasil isolasi  dilakukan spektroskopi proton 1H-NMR dengan menggunakan pelarut CDCl3 pada frekwensi 600 MHz. Dari Spektrum 1H-NMR senyawa triterpenoid hasil isolasi diketahui bahwa  terdapat empat puluh enam signal. Masing-masing signal terdistribusi pada kelompok proton  CH3 dan CH2 sejumlah empat puluh satu signal dan kelompok proton CH tiga signal.

Kelompok proton COOH satu signal dan kelompok proton alkena HC=C< ada satu signal. Selanjutnya agar signal yang dianalisa lebih jelas maka dilakukan ekspansi terhadap  daerah pergeseran kimia 0,8389 – 2,5145 ppm. Dari spektrum ekspansi 1H-NMR pada daerah  pergeseran kimia 0,8389 – 2,5145 ppm, diketahui bahwa senyawa ini memiliki sekelompok proton pada daerah δ : 0,80-1,54 ppm yang merupakan daerah pergeseran kimia dari proton CH2 dan CH3 atau kelompok proton sheilding (terlindung) yakni proton dari hidrokarbon jenuh (Santoni, 2009). Tujuh signal proton metil singlet (s, 3H), yang muncul pada δH 0,80; 0,84; 0,87; 1,03; 1,00; 1,05; 1,06 ppm, masing-masing untuk H-27, H-26, H-25, H-23, H-24, H-28 dan H-30, signal tersebut mendukung data NMR karbon DEPT yang menyatakan bahwa senyawa hasil isolasi memilki 7 karbon metil (CH3). Selanjutnya satu signal proton HC=C< muncul pada pergeseran kimia 5,71 ppm (t, 1H), sesuai untuk signal proton H-12, signal ini juga mendukung data karbon NMR DEPT yang menyatakan bahwa senyawa hasil  isolasi memiliki karbon CH dari alkena yang diperkirakan pada karbon 12 (C-12).

Selanjutnya senyawa ini juga memiliki sekelompok proton pada daerah δ : 1,73-2,51 ppm yang merupakan daerah pergeseran kimia dari proton CH (Pavia et al., (2009).  Dengan demikian senyawa triterpenoid hasil isolasi memiliki satu ikatan rangkap dua . Berdasarkan analisa 13C-NMR, DEPT dan 1H-NMR diketahui bahwa senyawatriterpenoid hasil isolasi memiliki 30 atom karbon yang terdistribusi pada 7CH3, 10CH2, 4CH dan 9C kwarterner serta 46 atom hidrogen yang terdiri dari 21 proton metil, 20 proton metilen, 4 proton metin dan 1 proton hidroksi dari asam karboksilat, maka berdasarkan data tersebut senyawa triterpenoid hasil isolasi memiliki rumus molekul C30H46O3 yang merupakan senyawa triterpenoid golongan oleanan dan dikenal dengan nama asam okso-3-

oleanen-12-oat-29.  Spektrum HMBC senyawa hasil isolasi dapadilihat pada Gambar 18. Spektrum NMR-HMBC memberikan konfirmasi letak proton terhadap karbon dengan mempelajari  korelasi yang terjadi (dua atau tiga ikatan) antara proton dengan karbon sehingga dapat  diketahui pola substitusi dari senyawa asam okso-3-oleanen-12-oat-29. Dari spektrum  HMBC diatas diketahui bahwa terjadi korelasi antara proton pada C-1, C-2, dan C-24 dengan C-3, korelasi proton pada C-19 dengan C-29 serta korelasi proton pada C-18 dengan C-12 dan C-13. Dengan demikian diketahui bahwa substituen keton benar terletak pada C-3 dan asam karboksilat pada C-29 serta ikatan rangkap dua pada C-12 dan C-13. Analisa spektrum HMBC tersebut mendukung data-data spektroskopi sebelumnya dan juga mendukung usulan  bahwa senyawa hasil isolasi adalah senyawa asam okso-3-oleanen-12-oat-29.

Berdasarkan analisa spektroskopi UV,IR, 13C-NMR, 1H-NMR, DEPT, dan HMBC, serta pengujian dengan pereaksi Liebermann-Burchad maka senyawa hasil isolasi dari ekstrak  etil asetat kulit batang tumbuhan kecapi diusulkan sebagai senyawa dari golongan  triterpenoid pentasiklik turunan oleanan dengan nama asam okso-3-oleanen-12-oat-29. Selanjutnya berdasarkan penelusuran pustaka, senyawa yang diusulkan untuk senyawa hasil isolasi sudah pernah ditemukan sebelumnya dari tumbuhan yang sama di Malaysia, yaitu senyawa okso-3-oleanen-12-oat-29 yang memiliki aktivitas anti kanker (Kaneda et al., 1992), anti karsinogenik (Ismail et al.,2003) dan anti inflamasi (Rasadah et al., 2004). Akan tetapi untuk mengetahui lebih jelas stereokimia dari senyawa asam okso-3-oleanen-12-oat-29 dan untuk membuktikan bahwa senyawa hasil isolasi persis sama dengan literatur, maka perlu dilakukan elusidasi struktur lebih lanjut dengan spektroskopi lainnya dan kemudian dibandingkan dengan literatur.

Kesimpulan

Berdasarkan analisa spektroskopi UV, IR, 13C-NMR, 1H-NMR, DEPT, dan HMBC, serta pengujian dengan pereaksi Liebermann-Burchad maka senyawa hasil isolasi dari ekstrak etil asetat kulit batang tumbuhan kecapi diusulkan sebagai senyawa dari golongan triterpenoid pentasiklik turunan oleanan dengan nama asam okso-3-oleanen-12-oat-29.

SUMBER :

 https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:q6K2z0UJeq4J:pasca.unand.ac.id/id/wp-content/uploads/2011/09/ARTIKEL-ERMA-SURYANI-M.Si_.pdf+isolasi+senyawa+turunan+terpenoid&hl=id&gl=id&pid=bl&srcid=ADGEESgg8HxOO531urJ_3EgG-sGPFDg0qJ84xWwf6SvLdhYw75xv_MogKzTeC4Gq0mGCnVRkQUY03C9DJCKU_48Hprgu1_dcb0dYWhkfxddpJk5NOBq5dEmzbqP-TyTfgLkcvN_9Wqqs&sig=AHIEtbTQeOuxqotfqpsUIgDM-hXs0XsUuQ

PERMASALAHAN : 

1. Sebelum dilakukan elusidasi struktur senyawa hasil isolasi dengan spektroskopi terlebih  dahulu dilakukan identifikasi dengan menggunakan pereaksi Liebermann-burchard, hasil identifikasi terbentuk bercak warna merah, hal ini menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi  merupakan senyawa golongan triterpenoid, bagaimana kita bisa membuktikan hanya dengan pereaksi Liebermann- buchard bahwa hasil isolasi  merupakan senyawa golongan triterpenoid?

2. untuk mengetahui jumlah atam karbon primer, sekunder, tersier dan kuarterner dari  senyawa hasil isolasi maka dilakukan spektroskopi NMR karbon DEPT, sehingga kita dapat membuktikan bahwa senyawa itu adalah turunan terpenoid, yang ingin saya tanyakan bagaimana cara mengetahui jumlah atom karbon primer, sekunder, tersier dan kuartener dengan cara spektroskopi NMR karbon DEPT?